不管您是要建立一座沙堡、一个核反应堆还是一段新的恋情，亦或是一种新的蛋白质配方，稳定持久都是非常重要的指标。因此，我将兑现之前的承诺完成蛋白质配方系列文章；在这个系列中，我会深入研究喷雾干燥和冷冻干燥方法在蛋白质和多肽中的应用。本篇文章可以学习到更多关于如何使用这些技术方法来实现如何确定稳定的蛋白质配方。
最近，我看了一部关于坚固人造建筑的纪录片，例如胡佛水坝（Hoover Dam）和梅厄塔（Torre Mayor）。显然地，梅厄塔不仅在2003年的7.6级地震中幸存下来，当时在里面的工作人员甚至没有注意到颤动。
工程师们喜爱稳定，科学家们也是一样。每当我们进行蛋白制剂干燥时，就像那些工程师和建筑师一样，我们最关心的是如何实现产品的长久稳定性。通常配制的小分子制剂中水分含量足够低，所以可以不添加赋形剂就能让配方在较长时间内保持稳定。
另一方面，蛋白质要比多肽更加不稳定；它的稳定性与其构象结构和配方含水量都密切相关。蛋白制剂需要保持一定水分含量来避免变性，因此需要优化蛋白质配方和控制干燥工艺避免出现稳定性问题。在某些案例中，干燥过程中的蛋白质甚至会变得很不稳定，但如果没有发生聚合等不可逆反应，蛋白质仍可以完全再折叠，并在重构后表现出合适的药物稳定性。
一个精心设计的配方要考虑到分子特异性、过程中干燥应力、蛋白质生产和纯化的方法以及分子的降解途径。当然，接下来是确定蛋白质配方的技术参数：
通过喷雾干燥进行配制蛋白质制剂
喷干蛋白质样品高度依赖样品性质、仪器设计和过程参数设定。
影响最终产品质量的因素有：
* 形态
* 残留水分
* 颗粒大小
为减少蛋白质配方中蛋白质或多肽的热降解，应该多关注温度和滞留时间。各参数中出口温度是防止热降解的关键所在。
当出口温度低于蛋白质的降解温度时，物质所经受的热降解就会降低。但是出口温度过低会使残留水分增加，从而导致货架期缩短。所以重要的是找到理想的出口温度，既可以让样品变为干燥粉末，又不会引起蛋白质配方的降解。
通常，生物制药的蛋白质喷雾干燥其出口温度要低于100 ℃，同时进料速度都很低。
滞留时间对于最小化热敏性样品的热降解非常重要。表面水分含量高的细小颗粒喷雾更容易进行蒸发，所以他们的滞留时间很短；低水分含量的细小至半粗糙的喷雾，需要中等滞留时间；而残留水分更低的粗糙喷雾，则需要最长滞留时间。
根据研究报道，10 μm大小的纯水液滴蒸发需要0.03 s，100 μm的液滴需要3 s。
在蛋白质配方应用中，通常实验室级喷雾干燥仪的滞留时间在0.2到0.35秒之间。滞留时间根据干燥室体积和干燥气体流量决定。由于干燥室体积是恒定的，只有气体流量可以调节。大多数喷雾干燥仪都以最大干燥气体流量运行，以保证最大限度的喷干能力。
通过冷冻干燥进行配制蛋白质制剂
冷冻干燥过程中最关键的一步是预冻，因为它决定了干燥产品的微观结构。您需要在足够低的温度下进行冷冻产品，以使产品完全固化。大多数液体样品，包括蛋白质配方制剂，都是通过形成冰晶来完成冷冻。冰晶的大小和形状取决于冷却速度，并决定了颗粒的冻干能力。
快速冷冻会形成小冰晶，而缓慢冷冻则会产生大尺寸冰晶。在冻干过程中，小冰晶比大冰晶更难以从产品中除去。虽然如此，蛋白质制剂的预冻温度是由其特性和配方组成决定的。
配方制剂通常有两种不同的预冻方式。共晶混合物中包含物质的结冰点要低于周围的水。当共晶混合物进行冷冻时，水因为结冰会先从这些物质中分离出来的。从表面来看，蛋白质配方制剂已经冷冻，但其中的溶质物质仍然是液体状态。它们会形成浓度集中区域，最终在低于水的冰点温度下冷冻结冰。
当混合物中所有组分都被完全冻结时的温度称为共晶温度，也是蛋白质配方制剂的临界温度，是其在冻干过程中所能承受的最大温度。
由于未冻结的组分会在真空下膨胀，对未完全冻结的共晶混合物进行抽真空可能破坏样品。
另一类混合物是无定形样品，在冻结时会形成玻璃态。随着温度降低，蛋白质配方变得更加粘稠，最终在玻璃化转化点冻结成玻璃状固体。对于非晶体样品，稳定性方面的温度临界点称为塌陷温度，塌陷温度一般会略低于玻璃转化温度。通常，无定形样品的冷冻干燥非常困难。
蛋白质是具有相对较高的玻璃转化温度的分子，因此很容易进行冷冻和干燥。冷冻后，嵌入蛋白质的最终结构就形成了。如果结构不正确，蛋白质就会锁定在错误的构象中可能导致失去活性。因此，冷冻方法(慢vs快)及其对蛋白质完整性的影响非常重要。
通常对于初级干燥来说，您可以通过玻璃转化温度来确定搁板温度和干燥室压力，用以设定冻干循环参数。冻干处理的阶段时间可以使用工具确定，例如终点判定(温度和压力)或科学的知识经验。
初级干燥是利用分子热特性来进行的，而次级干燥循环则是利用分子热稳定性来进行。
搁板温度和冻干时间会影响产品活性。次级干燥也决定样品的残留水分等级，从而决定了产品的稳定性和保质期限。在产品保质期限内残留的水分会促使降解反应发生，所以应保持在一个较低的水平，通常残留含水量低于 3 %。
为您的蛋白质配方制剂提出一些建议：
* 蛋白质和多肽需要储存在 -80 ℃ 环境中，不建议在 -20 ℃。在储存之前，必须要过滤纯化的蛋白质成分。使用干冰/乙醇混合物来快速冷冻比在 -20 ℃ 环境下慢冻要好。为了增加储存、冻融周期过程中的稳定性，可以考虑在混合物中加入蔗糖或甘油。谨慎选择蛋白质制剂的溶剂，可以考虑使用保护剂，如海藻糖，用以稳定分子结构并帮助保持产品功能活性。
* 如果可以的话，请测量出蛋白质的降解温度，或者也可尝试测定蛋白质配方制剂（蛋白质+辅料）的玻璃转化温度。
* 在蛋白质配方中添加糖和糖类添加剂，以保护喷雾干燥和冷冻干燥的蛋白质免受脱水和热应激效应的影响。
* 考虑蛋白质配方设计是否选择了合适的干燥方法。对于不适合进行冷冻干燥的蛋白质配方，则很难设计出合适的冻干循环参数。例如，磷酸盐缓冲盐溶液的蛋白质样品极难进行冷冻干燥处理。
* 为每个样品开发和优化冷冻干燥方法：一个方法并不适合所有产品。
冷冻干燥前的预冻方法会明显影响冰晶结构的形成，进而影响初级干燥和最终产品中水蒸气的流动。尝试控制溶液的预冻冻结方式，以缩短冻干时间，获得更稳定的蛋白质配方制剂。
希望您可以从这篇文章中了解到相关的知识，让我们看看您的蛋白质制剂是否和胡佛水坝一样坚固持久吧！
下次见！
