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1形态
通过光学显微镜、扫描电子显微镜（SEM）或者透射电子显微镜（TEM）观察微球的形态，微球形态与结构的不同对微球的载药量以及释放行为有显著影响[1]。表面粗糙的微球易吸附药物结晶，往往会导致高突释。通过对微球形态的观察，总结不同工艺处方对其形态的影响，同时优化制备工艺及处方，还可以改善微球的释放行为。
SEM是目前观察微球形态使用最广泛的方法，被用于表面及切面形态的观察（见图1）。TEM 分辨率高，图像为二级结构平面，适用于亚微球、纳米球粒径测定。此外还有原子力学显微镜(atomic force microscopy，AFM)可用于观察微球形态，AFM 优点之一是分辨率高，与 SEM 相比，不需要对样品进行金属喷镀，避免了喷镀后对样品的表面形态造成的破坏，并且AFM 允许在液态环境下观测样品，而 SEM 则不行。但是 AFM 缺点是观察范围窄，得到数据不具有统计性，适合单个粒子表面形态的观察。
图1 SEM观察的PLGA-Glu微球图像
(A)全视图 (B)单个微球表面图 (C)单个微球切面图
2粒径及分布
粒径大小及其分布是影响微球制剂释放行为的关键因素。粒径测定的方法有多种，动态光散射（DLS）、激光衍射法（LLD）、TEM、SEM、AFM等。粒径的分布除了可用粒径分布图表示，还可用多分散性指数( polydispersity index，PDI) 和跨距表示[2]。跨距与多分散性指数数值越小，表示粒径分布越均匀。
3载药量/包封率
载药量和包封率是反映微球制剂中药物含量的重要指标，载药量的批间稳定性是工艺成熟的重要标志，也是衡量制备工艺和成本的重要指标[3]。
载药量和包封率的计算都需要建立在药物含量测定的基础上，目前上市的微球制剂所用载体多为聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)。由于 PLGA 易溶于二氯甲烷、三氯甲烷、二甲亚砜等有机溶剂，而不溶于水、醇。依据药物和 PLGA 的溶解性质，PLGA 微球常用的含量测定方法有：
① 先用有机溶剂溶解 PLGA 和药物，再用不溶于 PLGA 溶剂沉淀 PLGA，经过离心或过滤后，取上清进液相测定含量；
② 先用有机溶剂溶解 PLGA 和药物，再加入醋酸盐缓冲液等溶剂提取多肽后进样分析；
③ 溶剂溶解 PLGA 及药物后，直接进样测定。
方法①和②需要在测定之前将高聚物与药物分离，而且分离过程使用的试剂容易导致药物损失。方法③的优势在于无需将高聚物与药物分离，但是应用较少，需要使用质谱等特殊仪器。
4释放行为、突释效应和渗漏率
1) 释放行为
在载药微球的研发阶段，应确定好合适的体外释放条件，并根据体内释放条件建立体内、体外相关性。对于释放周期较长的载药微球，可以建立加快释放试验的方法，预测模拟常规释放行为[4]。建立加速释放的条件要遵循相关性原则，使加速释放曲线尽量拟合常规释放曲线，得到准确的相关性。
释放行为是根据临床适应症需求和高分子聚合物材料性质共同决定的。选择合适的高分子聚合物材料与工艺制备不同结构的载药微球，使活性成分按照预期的药代动力学模型释放。对于可生物降解材料，溶胀和溶蚀机制也是控制药物释放的主要因素。释放介质的组成、pH 值、离子强度、渗透压和温度等都会对释放速率产生影响。
2) 突释效应
在微球释放的最初阶段，吸附在微球表面的药物会通过扩散作用而快速释放，称为突释效应[5]。突释效应可能导致人体内药物浓度在短时间内迅速升高，并使得药物效期缩短，是限制微球广泛应用的关键问题，因此在质量控制过程中必须重点关注突释率这一指标。目前主要通过体外释放度实验考察微球的突释效应。
2020 版《中国药典》明确规定载药微球在前 0.5h 内释放的药物含量要低于40%。缓释微球制剂的体外释放方法，目前并没有统一的标准要求，目前报道的微球制剂体外释放度测定方法主要有：
① 直接释药法，这是目前最常用的方法，包括摇床法和恒温水浴静态法。
② 流通池法，此法已被美国药典收载，被广泛应用于缓释制剂的研究。
③ 透析膜扩散法，该法是指将微球放入透析管中，并将其放入介质中测定。3种方法优缺点比较见表1。
表1 微球制剂体外释放度实验方法的比较
除了改进体外释放度的实验装置，还可以通过调节释放介质温度、pH值、离子强度、搅拌速率以及使用表面活性剂、酶等方式能实现微球体外加速释放，而达到缩短检验周期，提高检验效率的目的。
3) 渗漏率
微粒制剂应检查渗漏率，可由下式计算：
渗漏率=产品在贮存一段时间后渗漏到介质中的药量/产品在贮存前包封的药量×100%
5有关物质和杂质分析
鉴于已上市的产品大部分为多肽微球，其相关杂质包括降解杂质、工艺杂质以及聚合物杂质：
降解杂质包括药物在生产、储存过程中发生水解、氧化反应而生成的产物。
工艺杂质中得到最广泛关注的是乙酰化杂质，这类杂质是由药物多肽中的氨基、羟基与PLGA的羧基末端经过化学反应生成的，这种杂质目前在PLGA微球中广泛存在。乙酰化杂质的产生与多肽自身结构有关，质谱和毛细管电泳技术联合使用可用于其他多肽微球的乙酰化杂质检测。
聚合物杂质包括多肽或蛋白自身相聚合形成的杂质，以及聚合物-多肽杂质。
6Zeta电位测定
Zeta电位也是微球的一个重要属性，Zeta电位往往能指征微球制剂的稳定性，而这一指标却容易被忽视。在微粒分散体系的溶液中，其表面带有同种离子，通过静电引力吸附和扩散作用，在微粒周围形成的吸附层与相邻的扩散层共同构成微粒的双电层结构，从吸附层表面至反离子电荷为零处的电位差叫动电位，即Zeta电位。Zeta电位值可以反映微粒的物理稳定性，Zeta电位越大，微粒之间的排斥作用越强，絮凝或沉积的可能性越小，微粒在溶液中越稳定。一般Zeta电位绝对值大于15mV，可以达到稳定性要求。
7有机溶剂残留
生产过程中引入的油相（有机溶剂）在固化的过程中会存在未能完全除去的问题，如丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷等残留，不仅影响微球储存的稳定性，还会在注射后引起人体的副作用，因此必须对其限度进行控制。
残留溶剂一般采用气相色谱法来测定。此外，对于固体无菌粉末制剂，一般都要求控制水分的含量。由于微球制剂大都是多肽或蛋白类药物，这类药物对热不稳定，因此不适合采用干燥失重的方法测定水分，可以采用卡尔-费休氏水分测定方法来完成。
8微生物检查
微球制剂的细菌内毒素和无菌检查，需要进行球内和球外部检测实验，一般冻干制剂要求更加严格。微球的粒径远大于真菌和细菌，因此表面及内部均存在污染可能。
微球外部实验，旨在检测制剂完成生产灌装入瓶中时的微生物和细菌内毒素; 微球内部实验，旨在检测微球内部包含的微生物和细菌内毒素。
可采用直接接种法对利培酮微球内部和外部进行无菌检查，在内部无菌检查过程中，先用2 mL 二甲基亚砜将微球溶解和破碎，将溶解后全部液体接种至20 mL 培养基中，运用显微镜观察溶解和培养过程[6]。
这种内部检查方法经方法学验证表明各验证菌生长情况良好，使用浓度小于10% 的二甲基亚砜不会影响微生物的生长，可应用于微球制剂的无菌检查。
9载体辅料特性检测
微球制剂的缓释功能是通过载体辅料实现的，这些载体辅料通常无毒、可降解且具有良好生物相容性。最常用的微球关键辅料包括聚乳酸、聚羟基丁酸酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物等。此类辅料的黏度、分子量及分布范围、组成单体的比例、单体残留量、酸值、及玻璃转化温度等指标都会影响微球的释放周期和释放速度。
（中国粉体网编辑整理/青黎）
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