【AAV】DLS+SEC+DSC多种技术结合，助力AAV基因递送载体的表征

DLS可用于样品关键生物物理参数的测量，或用于筛分优质、稳定的的样品和那些受污染、有聚体的样品。通过Zetasizer Ultra纳米分析仪的多角度动态光散射技术（MADLS），不仅可以在几分钟内测量样品的流体动力学直径和粒径分布（包括聚集体），还可以测量每个群体的颗粒浓度。此外，仪器新的自适应相关算法提高了测量精度、重现性，以及对异物或大的聚集体的包容度。

图1. Zetasizer Ultra纳米粒度仪和DLS测量粒径分布的案例

使用MADLS技术

进行AAV载体大小和浓度测量

本文用Zetasizer Ultra分析了3个AAV样品。浓度结果与基于衣壳ELISA的病毒滴度测定的结果进行对比。

采用多角度动态光散射（MADLS）技术测量3个AAV样品的颗粒大小分布，重复测量3次，结果如下。显示有少量样品团聚。标准品（A）发生的团聚比AAV样品（B和C）更多一些。同时分别测得了AAV单体和团聚体的颗粒浓度，结果见图D-F。表1中对比了MADLS方法和衣壳ELISA法测得的浓度结果。AAV样品的RSD<15%，ATCC AAV2参考标准品的RSD 45%。

图2. 颗粒大小分布的3次重复测量结果：图A-ATCC AAV2标品，图B-AAV样品1，图C-AAV样品2。图D-F的颗粒浓度结果一一对应图A-C中的样品。

采用AAV衣壳ELISA方法进行测量

酶联免疫吸附试验 (ELISA) 是病毒滴度或衣壳浓度的标准测量方法。我们将MADLS浓度数据与已有的衣壳ELISA方法测量的数据进行比较。单分散rAAV样品（RSD 13-15%）与ELISA方法测量的rAAV衣壳滴度几乎没有差异。

这些结果表明了完整 rAAV 衣壳的无标记分析方法与其他常见滴度测定方法是互补的。发生团聚的多分散rAAV样品的RSD高达45%。我们认为这是因为多分散样品的尺寸精度较低。

表1. 衣壳ELISA测得的浓度数据和MADLS测定的颗粒浓度数据，3个样品分别是ATCC AAV2参考标准品，样品1，样品2。浓度数据单位是颗粒数量/ml。n表示3次重复测量中观察到该峰的次数。n/a表示未观察到该峰。

多检测器尺寸排阻色谱（SEC）可用于多种rAAV属性的测量，如衣壳滴度、绝对分子量、聚集体、寡聚体、片段分布和空壳率。

市售rAAV5样品（Virovek，US）含有空衣壳和完整衣壳的混合物。完整衣壳rAAV样品Mw是4.49x10⁶ g/mol，蛋白质含量86%，ssDNA Mw 6.13x10⁵ g/mol，完整衣壳AAV占比78.1%，总滴度7.48x10¹³（单体和聚集体）。空rAAVs Mw小一些，3.84x10⁶ g/mol，总滴度5.91x10¹³（单体和聚集体）。当空衣壳和完整衣壳以已知比例添加时，测得的空壳率与预测结果高度相关，R²高达0.99。

图3. OMNISEC系统和示例色谱谱。示例中样品为空rAAV单体、二聚体、高聚体和片段的混合物。针对单体峰进行空壳率分析。

图4. OMNISEC空壳率分析结果。预估值（表格第三列）来自添加的空衣壳和完整衣壳比率，调整到100%。基于Mw得到完整衣壳占比 78.1%。计算值（表格第四列）基于单体峰的Mw值得到。

差示扫描量热仪（DSC）可用于测量蛋白质、核酸和病毒衣壳的热变性和热稳定性。该技术测量溶液中分子热诱导的结构变化的焓变（ΔH）和结构转变温度（T_m）。该测量方式直接、溶液相和非标记，不需要额外的荧光标记或抗体捕获。

空衣壳和完整衣壳rAAV5样品（Virovek, US）的PEAQ-DSC结果显示有多个转变温度（T_m），与衣壳分解（T_m1）和ssDNA熔融（T_m2）有关。此外，完整rAAVs在50度时显示出弱的热特征，而空壳rAAVs没有，这表示热诱导事件的发生可能与衣壳脱壳相关的完整rAAVs里的结构重组有关。

图5. MicroCal PEAQ-DSC自动系统和完整rAAV的DSC热图谱示例。图谱显示了明显的热转变温度（T_m）分别是89°和94°。红星号标注出早期的热转变发生在50°。