从天然产物中寻找活性成分，全世界很多科研工作者一直在开展这项工作，特别是新冠疫情以来，科学家们也期待从天然产物中筛选出疗效确切的抗病毒成分。本应用案例采用一个全新的方法组合：通过水提取，结合喷雾干燥&制备色谱联用技术来探索简单、快速、经济地获取高纯度天然活性成分红桤木素（纯度>95%）以及商业化的可行性，整个过程也极大减少了有机溶剂的使用，该方案也可以用于其它天然产物加工工艺中。我们在此分享，希望能给广大科研同仁提供一些思路参考。
红桤木是广泛分布在北美太平洋西北部的硬木树种，呈金黄色，也叫黄金桤木，喜温暖气候，出材率高，材质坚硬有弹性和韧性。一般取芯材做木材后，丢弃了很大部分的树皮、树枝、叶子和较小茎等，这些残留物被留在森林中、用作燃料、堆肥等。但其实里面含有药用价值很高的天然产物化学物质，具有治疗发烧、出血、烧伤、抗氧化、抗菌和抗癌的特性。发挥该药用价值的主要活性成分是二芳基庚烷类化合物，其中的红桤木素{Oregonin，(5S)-1,7-bis(3,4-dihydroxyphenyl)-5-(β-D-xylopyranosyloxy)-heptan-3-one}含量最高，在叶子和树皮中浓度高达4-9%。因此寻找工业化的提取、干燥和纯化工艺处理大规模的林业加工残留物，从而实现红桤木更多的商业化价值。
红桤木素和其它二芳基庚烷类化合物传统的提取方法是采用氯仿、二氯甲烷、甲醇等有机溶剂进行索氏提取，该方法会溶解一部分植物中脂和蜡，后续需要进行脱脂处理，操作比较麻烦；同时有机溶剂的提取也不容易扩展到工业化生产。故直接采用水提法得到目标化合物，既经济又环保更安全；同时红桤木素在103 ℃时易于降解，水萃取液如何除水就是一项挑战了。对于热敏性水提物的干燥方式常用冷冻干燥进行。但冻干需要的设备投入更大、耗时长、生产成本极高。故采用经典的喷雾干燥法开辟一条新的可实现的工业化工艺。
01 仪器
02 水提取
将红桤木叶、嫩枝和树皮（50克）用水浸泡（150毫升），考察不同提取温度（20/35/50/65 ℃），高速搅拌机搅拌10分钟。所得浆液在实验室环境温度（22 ℃）下继续搅拌 30 分钟，随后过滤以去除不溶性植物残留物。过滤后的提取物在室温下以 1400 rpm 的转速离心 12 分钟。所得上清液为半透明、橙褐色液体，待后续使用高效液相色谱法测试活性成分和喷雾干燥使用。
03 水提物的喷雾干燥
将不同温度下获得的提取液经喷雾干燥得到粗红桤木素提取物粉末。喷雾干燥工艺使用瑞士步琦公司小型喷雾干燥仪B-290进行，二流体喷嘴（喷嘴0.7mm和1.5mm喷嘴帽），搭配高效旋风分离器。实验中以最大程度减少粉末损失，低出风温度，收集瓶中物料含量来进行参数考察。喷雾干燥物料溶液固含物浓度约为1g/100ml。
优化的工艺参数为：
进风温度190℃，
出风温度90℃，
干燥气流量Aspirator 80%，
进料速度20mL/min。
红桤木素的产率计算：
喷雾干燥所得粉末重量占进料水提液中总溶解固体重量的百分比。
红桤木素的降解率计算：
喷雾干燥粉末中活性物含量与进料中溶解固体的红桤木素含量的比率。
考虑到喷雾干燥是一种热处理方式，工艺工程中可能导致物质降解，有必要了解工艺过程中对活性物质的影响。
04 谁提物喷雾干燥粉的分离纯化
将喷雾干燥提取物干粉重新用蒸馏水溶解，配制成浓度为10%（w/w）的溶液，使用制备液相色谱（Flash）系统进行纯化来获得目标活性成分，采用液体上样模式，批次进样15mL。
纯化条件：
洗脱溶剂：A:乙腈 B:水
初始平衡条件：水/乙腈(85:15% v/v)
色谱柱：商品化C18 Flash柱，(填料重量120g, 填料颗粒粒径 20–25 μm)
流速：40 ml/mim
检测波长：280 nm
梯度洗脱：合计 30 min
纯化过程中收集的洗脱液馏分通过高效液相色谱（HPLC）方法分析，根据色谱峰面积法初步评估目标成分含量，馏分中红桤木素含量大于85%的进行合并，并通过喷雾干燥进行干燥，用于获得干燥产物。为了进一步评估峰面积法判断准确性，每次进样后测定的含最高浓度红桤木素馏分进行合并，再干燥，对比标准品， 通过HPLC方法进行含量测定。在我们的研究中，要获得纯度大于90%的红桤木素，可以轻松实现，回收率高达90%；当纯度要求大于95%时，回收率将降低至45%以下。
05 HPLC分析
采用 HPLC 方法进行水提物和水提物喷雾干燥粉，以及Flash制备色谱纯化后收集的馏分的检测分析。色谱柱 C18 column (4.6 mm × 150 mm, particle size: 2.6 μm, pore size: 100 ?)，进样量1μL, 流速1.0 mL/min。
下表为HPLC分析梯度洗脱条件：
06 结果分析与讨论
提取工艺，喷雾干燥产率和活性物质降解率：
上面表格中详细记录了不同提取温度下提取液的喷雾干燥产率，热降解率等。
从上表可以观察到，在 20-50℃ 的提取温度下，通过喷雾干燥除去溶剂后得到的红桤木素降解率不到 10%。但在65℃时，降解率翻了一番以上，达到 21%。提取温度为35℃时，喷雾干燥产率最高，为 75%。上述这一参数最终被采用，并进行后续的纯化工艺。水提物中的红桤木素浓度与提取温度呈显著的正相关（R=0.95，P=0.046）；然而，上述因素和工艺产率（R= -0.095，P=0.9）以及实际喷雾干燥粉末中的红桤木素浓度（R=0.4，P=0.6），无显著关联。虽然喷雾干燥的进风温度高达190℃，但是因为水分的蒸发是一个快速的吸热过程，随着蒸发的进行系统温度不断降低，物料在干燥过程中没有接触太高的温度。而且喷雾干燥过程中，物料在干燥筒中停留时间短，所以可实现较低的红桤木素降解率。当然设置更低的加热温度，也可以进一步降低热降解率，但进料速度也会随之降低。虽然本次实验物料浓度低，固含物少，但喷雾干燥实验过程平均产率仍能达到 70%，也达到实验室喷雾干燥仪常见的回收率要求。另外，喷雾干燥提取物粉末颗粒是一种水溶性的棕色无定型态固体，有轻微的粘性和吸湿性。未来可以通过改进工艺，例如通过添加包封剂、抗黏剂，潜在地改善粉体粘性和吸湿性等。
制备液相色谱/Flash系统纯化方法可靠性评估：
进行5次重复进样，通过制备色谱纯化，使用HPLC方法检测各馏分中红桤木素的含量。上表列出了单次纯化工艺中，含最高红桤木素浓度馏分的分析结果，包括红桤木素回收率百分数和纯度（按单个馏分中红桤木素峰面积除以所有峰面积计算），相对标准偏差。红桤木素主要分布在Flash纯化后的两组馏分中，两组纯度分别为 85.35% (3.11% RSD) 和 95.83% (1.00% RSD)。合并两个馏分后，平均回收率为 90.25% (2.33% RSD)。上述结果RSD%都小于5%,表明采用的纯化方法对测定回收率和纯度都具有出色的可重现性。为了验证根据峰面积判定纯度的准确性，红桤木素纯度>95%的馏分液被干燥，通过HPLC方法，参照标准品进行红桤木素的含量测定。
使用 80g 和 120g 的商品 Flash 柱，考察不同进样量和流速对活性物质分离的影响。80g Flash 色谱柱子的上样量和流速为 10mL、40mL/min；120g 柱子的上样量和流速为 15mL、60mL/min。上图显示了 280nm 检测波长下，红桤木素 Oregonin 在制备液相/Flash系统的分离情况，可以看出两种色谱柱，两种进样量，红桤木素都有着相似而且较好的分离结果，出峰时间 10-15min。红桤木素在 120g 色谱柱的洗脱时间比 80g 色谱柱稍晚（分别为馏分 8-10 与馏分 6-8），但这细微的差异可能是由于色谱柱填料的系统误差造成的，并不影响方法稳定性以及工艺放大可能性。
07 结论
通过本研究，可以使用简单经济的水提取工艺，最大限度地减少有机溶剂的使用；喷雾干燥高效快速地去除提取溶剂，使红桤木素产率达 70% 以上，降解率也控制在 10% 以内；制备色谱纯化方法验证中，各项指标的 RSD 均在规定的 5% 以内，同时也可纯化得到纯度达 95% 以上的二芳基庚烷类红桤木素。可见通过改良传统萃取方法，采用喷雾干燥和制备色谱联用技术，有利于实现天然产物从小试扩大到生产工艺中。
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应用文献来源：Efficient purification of the diarylheptanoid oregonin from red alder (Alnus rubra) leaves and bark combining aqueous extraction, spray drying and flash-chromatography
